太原理工大学 | 陈虎,翟春鹏,王莹,吕永康:一株寡养单胞菌属菌L12在高La(Ⅲ)浓度下的SND降解特性

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一株寡养单胞菌属菌L12在高La(Ⅲ)浓度下的SND降解特性

陈虎¹，翟春鹏²，王莹²，吕永康^1,2

¹太原理工大学环境与生态学院，山西 太原 030024；²太原理工大学化学与化工学院，省部共建煤基能源清洁高效利用国家重点实验室，山西 太原 030024

引用本文

陈虎, 翟春鹏, 王莹, 等. 一株寡养单胞菌属菌L12在高La(Ⅲ)浓度下的SND降解特性[J]. 化工进展, 2026, 45(4): 2409-2420.

>>DOI：10.16085/j.issn.1000-6613.2025-0583

将筛选的菌株接种到NM固体培养基中，生物培养箱30℃培养36h，观察菌株形态。将培养的菌株送至艾基生物技术公司提取细菌基因组DNA，采用通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TTGGYTACCTTGTTACGACT-3′）扩增16S rDNA序列并测序。通过BLAST将测得的基因序列与美国国家生物技术信息中心（NCBI）Genbank中其他微生物的序列进行对比，然后通过MEGA 11软件采用邻接法（neighbor-joining）来构建菌株的系统发育树。

采用单因素控制变量法分别从不同碳源（乙酸钠、葡萄糖、柠檬酸钠、丙酮酸钠、丁二酸钠）、C/N比（8、10、12、14、16、18）、初始pH（5、6、7、8、9、10、11）、温度（15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃）、初始氨氮浓度（0、50mg/L、100mg/L、200mg/L、500mg/L、1000mg/L）、La(Ⅲ)浓度（0、5mg/L、10mg/L、25mg/L、50mg/L、75mg/L、100mg/L、200mg/L）这6个方面研究不同环境因素对菌株L12硝化性能的影响。每组实验设置3组平行样，将培养9h处于对数期的菌株L12的菌悬液（1mL）接种到La(Ⅲ)浓度为10mg/L的100mL NM培养基中，培养60h。除改变单一变量元素外，其他培养条件均为30℃、120r/min、10mg/L La(Ⅲ)和初始pH为7.0。每组实验进行期间，每隔12h取菌悬液，测定其OD₆₀₀（溶液在600nm波长处的吸光值），离心（10000r/min，5min）后取上清液，测定其氨氮（NH₄⁺-N）、亚硝态氮（NO₂^--N）、硝态氮（NO₃^--N）、总氮（TN），化学需氧量（COD）的浓度和pH。

取培养9h处于对数期的菌株L12的菌悬液1mL，分别接种于以氨氮为唯一氮源的NM培养基（100mL）和以硝酸钠或亚硝酸钠为唯一氮源的DM培养基（100mL）中，在30℃、初始pH为8.0和120r/min条件下培养60h，每隔12h取菌悬液，测定其OD₆₀₀，离心（10000r/min，5min）后取上清液，测定其氨氮、亚硝态氮、硝态氮、总氮，COD的浓度和pH。

在含100mL NM培养基[La(Ⅲ)浓度为10mg/L]的250mL气密瓶中，接种1%活化后的菌液后充满高纯度氧气，然后密封瓶口，30℃、120r/min培养36h，收集0h和36h瓶内气体用于N₂分析，然后收集菌液，测量其总氮TN₁的浓度，离心（10000r/min，5min）后取上清液，测量其氨氮、亚硝态氮、硝态氮和总氮TN₂的浓度。根据式(1)、式(2)计算细胞内氮（TN_in）和细胞外有机氮（Ne-org）的浓度。

以1%接种量将处于对数期的菌株L12菌悬液接种于La(Ⅲ)浓度为10mg/L的NM培养基中，在30℃、120r/min条件下培养，18h时取菌液离心（10000r/min，10min），用磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）清洗、重悬，重复3次后冰浴条件下超声波粉碎20min（工作7s，间隔4s），收集粗酶液。蛋白质含量用考马斯亮蓝法测定，氨单加氧酶（AMO）活性采用氨单加氧酶检测试剂盒（江苏酶免实业公司）测定，羟胺氧化还原酶（HAO）、亚硝酸盐还原酶（NIR）和硝酸盐还原酶（NAR）活性通过反应中羟胺、亚硝酸盐和硝酸盐的减少量测定。

将培养菌株L12送至伟寰生物科技有限公司（上海），提取细菌基因组DNA后，基于Illumina HiSeq平台进行基因组框架测序。测序的结果经过过滤、组装和优化，结合NR、GO和KEGG数据库中与N代谢相关的功能基因及代谢通路对菌株L12进行基因预测和功能注释。

采用紫外-可见分光光度计在波长600nm处测得的吸光度来反映菌株的生长情况。水中氨氮、亚硝态氮、硝态氮和总氮、COD的浓度分别用纳氏试剂分光光度法（HJ 535—2009）、N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法（GB 7493—1987）、水杨酸-浓硫酸分光光度法（HJ/T 346—2007）、碱性过磺酸钾消解紫外分光光度法（HJ 636—2012）和重铬酸钾-硫酸银法（HJ 828—2017）测定。采用pH计（FE28，梅特勒）测定pH。氨氮、硝态氮、亚硝态氮以及COD去除率η的计算方法如式(3)所示。

从废水中经富集、驯化和分离后，得到一株耐镧异养硝化-好氧反硝化细菌，命名为L12。从图1(a)中可知，菌株L12在固体NM培养基上显示为浅红色，菌落呈圆形，表面平滑，边缘规则。采用16S rDNA通用引物成功扩增16S rDNA，经测序获得长度约为1540碱基对的目标基因片段。将该片段提交至GenBank数据库，得到菌株L12的基因序列号为PV 163852。利用基于局部比对搜索工具（BLAST）对菌株L12的16S rDNA序列进行同源性序列比对，构建的系统发育树如图1(b)所示。发现其与寡养单胞菌属（Stenotrophomonas sp.）多个成员关系密切，其中与Stenotrophomonas beteli ATCC19861（登录号：NR 040804.1）相似度最高，达99.57%，故初步判定该菌株为寡养单胞菌属。该菌属已被报道对金属如Cd、Zn有一定耐受作用，因此有必要开展对菌株S. L12在含镧离子废水中的脱氮性能的相关研究。

2.2.1  碳源

如图2(a)所示，菌株L12能够以乙酸钠、丁二酸钠和丙酮酸钠为唯一碳源进行生长。这些碳源比较容易被细菌利用，因为它们参与了三羧酸（TCA）循环，产生更多的还原态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和腺嘌呤核苷三磷酸（ATP），电子传递系统活性（ETSA）较高。而当以丁二酸钠为唯一碳源时，菌株L12的OD₆₀₀、氨氮和总氮去除率均达到最高（p<0.05），分别为1.33、88.92%和87.67%。因此，在研究范围内选择丁二酸钠作为菌株L12的最佳碳源，这与许多异养硝化-好氧反硝化菌选择相一致。

2.2.2  C/N比

C/N比对菌株L12生长及氨氮利用性能的影响如图2(b)所示，当C/N比不高于12时，菌株L12的氨氮去除性能随着C/N比增加呈现先略微下降后显著升高的变化趋势，C/N比为12时氨氮去除率最高（p<0.05），为77.74%。之后继续升高C/N比，氨氮去除率基本保持不变（p>0.05），这是因为细菌的HN-AD性能是有限的，达到最高水平后继续提高C/N比并不会继续提高硝化过程中微生物的代谢和电子传递速率。

2.2.3  温度

如图2(c)所示，低温下（15~20℃）菌株生长和氨氮去除性能受到明显抑制，20℃时菌株氨氮去除率仅为19.74%。温度升高至25℃时，菌株延滞期缩短，24h时OD₆₀₀达到1.27，氨氮去除率为86.94%。30℃和35℃菌株生长最为快速，24h的OD₆₀₀达到1.54和1.57，同时氨氮和总氮去除率显著高于其他温度（p<0.05），分别为98.40%和97.69%。而40℃时温度过高，脱氮酶活性也会受到抑制，24h时的氨氮去除率有所降低，为82.91%。综上，30~35℃为菌株的最佳生长温度范围，这与之前报道的大多数HN-AD细菌最适温度范围接近。

2.2.4  初始pH

如图2(d)所示，初始pH为5和11时，菌株基本不生长，氨氮浓度基本不变，这说明pH过高或者过低都会抑制菌株生长及脱氮性能。初始pH为8~10时，菌株OD₆₀₀均不低于1.31，硝化能力最强，氨氮去除率均在90%以上。总体来说，弱碱性条件下的菌株L12生长速度最快，且氨氮去除率略高于中性（pH 7，82.94%），远高于酸性（pH 6，49.79%）。在其他HN-AD细菌中也观察到这一趋势，可能是因为碱性环境中存在游离氨，从而促进了异养硝化过程。

2.2.5  初始氨氮浓度

图2(e)为初始氨氮浓度对菌株L12生长及氨氮去除的影响。缺少氮源（初始氨氮浓度为0）时，菌株L12基本不生长。当初始氨氮浓度为50mg/L和100mg/L时，菌株L12生长最快，氨氮处理效果最佳，24h氨氮去除率分别达到98.59%和98.02%。当初始氨氮浓度升高至200mg/L和500mg/L，菌株L12虽然仍保持生长，但生长速度减缓，氨氮去除率更是降至36.28%和23.97%，且24h之后氨氮也基本没有继续去除（图中数据未显示）。当初始氨氮浓度继续升高至1000mg/L，24h时的OD₆₀₀仅有0.84，且氨氮基本没有去除，这可能是由碳源不足和高浓度氨氮的毒性所致的。综合考虑菌株L12生长及氨氮去除性能，将初始氨氮浓度固定为100mg/L进行后续实验。

2.2.6  不同La(Ⅲ)浓度

在前文中探究了不同环境因素对菌株L12在含La(Ⅲ)环境下的氨氮降解性能的影响，得出菌株L12在10mg/L La(Ⅲ)环境下最优氨氮降解条件为碳源为丁二酸钠、C/N为12、培养温度为30℃、初始pH为8。后续本文将在上述最优条件下系统研究菌株L12在含La(Ⅲ)环境下的脱氮性能。菌株L12以氨氮为唯一氮源的脱氮过程如图3所示。前6h菌株处于适应期，生长比较缓慢，氨氮浓度缓慢降低至95.77mg/L，适应期比优化之前明显缩短。6~24h菌株处于对数期，OD₆₀₀值从0.03迅速增长到1.53，氨氮主要在这个阶段被迅速降解，24h已基本去除，去除率达到97.86%，高于HN-AD菌如Pseudomonas putida DS2的（91%）和卓贝尔氏菌（Zobellella）B307（96%）的氨氮去除率，其硝化过程中未出现明显的硝态氮和亚硝态氮积累。总氮和COD去除趋势与氨氮去除类似，最大去除率均发生在对数期，24h时总氮去除率为91.88%，COD去除率为83.85%。24~48h菌株进入稳定期，OD₆₀₀稳定在1.6左右，氨氮浓度稳定在1.5mg/L左右。培养48h后，菌株进入衰亡期，氨氮浓度上升至2.82mg/L，OD₆₀₀也略有下降，COD值已不足200mg/L，这可能是碳源不足引起菌株衰亡所致的。硝化过程中pH稳步上升，从初始的8.0上升到60h的9.2，过程中产生的弱碱性环境更适合菌株生长。

好氧反硝化主要指微生物在好氧条件下以有机物为碳源和电子供体，以氧气和硝态氮为电子受体，将硝态氮还原为氮气的酶促反应过程。首先，考察了La(Ⅲ)存在下菌株L12以硝酸钠为唯一氮源时的好氧反硝化性能。如图4所示，与氨氮降解过程类似，前6h菌株L12处于延滞期，生长缓慢。培养6~24h时处于对数期，菌株L12的OD₆₀₀从0.01迅速增加至1.46，与此同时硝态氮浓度从6h的98.11mg/L降低到24h的38.09mg/L，12~24h的硝态氮平均去除速率最高，为4.75mg/(L·h)。18h时积累了13.33mg/L亚硝态氮，之后逐渐降低。推测菌株L12能利用亚硝态氮进行好氧反硝化。氨氮浓度无明显变化，一直维持在接近为零的状态。培养24h后菌株L12进入稳定期，48h时OD₆₀₀达到峰值1.55，硝态氮、总氮和COD均达到最高去除率91.32%、88.47%和95.94%，之前积累的亚硝态氮也被基本消除。48h以后菌株进入衰亡期，OD₆₀₀开始下降，硝态氮浓度出现反弹。

在La(Ⅲ)存在下菌株L12以亚硝酸钠为唯一氮源时的好氧反硝化性能见图5。菌株培养前6h OD₆₀₀基本不变，此阶段为菌株的生长停滞期；6~24h菌株进入快速生长期，OD₆₀₀从0.02增加至1.50，亚硝态氮浓度从97.23mg/L降低到40.55mg/L，18h时积累了7.73mg/L的硝态氮，之后被逐渐去除。24h以后菌株进入稳定期，36h时OD₆₀₀达到峰值1.55，亚硝态氮、总氮和COD去除率可达85.55%、84.43%和92.67%。48h时亚硝态氮去除率最高，为87.72%。此外，亚硝态氮为唯一氮源时产生氨氮要多于以硝态氮为唯一氮源产生的，这可能与亚硝态氮的毒性导致细菌死亡有关。综上可得，菌株L12在La(Ⅲ)存在下能够以硝态氮和亚硝态氮为唯一氮源进行生长和好氧反硝化，反硝化效果不如硝化可能是因为菌株相对更容易利用氨氮作氮源，这一现象在其他HN-AD菌株中也有出现。

上述研究结果表明，菌株L12在含La(Ⅲ)条件下能够分别以氨氮、硝态氮和亚硝态氮为唯一氮源进行生长，推测菌株L12具有异养硝化-好氧反硝化性能。随后，采用气相色谱检测菌株L12脱氮过程中的气态产物，结果发现菌株L12在含La(Ⅲ)条件下以氨氮为唯一氮源时可以生成氮气，进一步证明菌株L12的好氧反硝化性能。表2为氮平衡实验结果，表明菌株L12以氨氮为唯一氮源生长时有98.34%的氨氮被利用，其中约58.32%氨氮被同化为细胞内氮，35.82%转化生成氮气，3.35%转化为胞外的有机氮，基本没有硝态氮和亚硝态氮的积累，表明菌株L12在含La(Ⅲ)条件下氨氮代谢过程主要包括同化为有机氮，以及经异养硝化-好氧反硝化过程转变成氮气两种路径，这与大部分异养硝化-好氧反硝化菌脱氮过程类似。

在SND过程中，通常测定几种关键酶AMO、HAO、NAR和NIR的活性用来分析细菌的氮代谢途径。其中，AMO负责将氨氧化为羟胺，HAO将羟胺氧化为亚硝酸盐，而NAR和NIR分别负责硝态氮和亚硝态氮的反硝化过程。如表3所示，菌株L12在含La(Ⅲ)条件下的氨氮利用过程中，4种脱氮关键酶活性均被检测出来，HAO、AMO酶比活力为0.082U/mg protein和0.134U/mg protein（U为每分钟催化1μmol底物反应的酶量，mg protein为每毫克蛋白中的酶活性），高于斯氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）ADP-19的HAO（0.020U/mg protein）和AMO（0.011U/mg protein）的酶比活力；NAR、NIR酶比活力为0.045U/mg protein和0.031U/mg protein，远高于根瘤菌属（Rhizobium sp.）WS7的NAR（0.006U/mg protein）和NIR（0.002U/mg protein）的酶比活力，从酶活水平证明菌株L12具有异养硝化-好氧反硝化性能。

为深入研究菌株L12在含La(Ⅲ)条件下的脱氮路径，对其基因组框架进行测序，将获得的结果在美国国家生物技术信息中心（NCBI）提供的BLASTx与NR数据库中用脱氮相关蛋白编码基因进行比对和注释，其结果如表4所示。在菌株L12基因组序列中检测到多个参与反硝化过程的关键酶基因，其中包括编码呼吸型硝酸盐还原酶（Nar）的功能基因narG/narH/narI/narJ、编码周质硝酸盐还原酶（Nap）的功能基因napA、编码异化型亚硝酸盐还原酶的功能基因nirS/nirK、同化型亚硝酸盐还原酶的功能基因nirB/nirD和编码一氧化氮还原酶（Nor）的功能基因norB。这些反硝化关键酶基因的存在，为菌株L12在含La(Ⅲ)条件下的异养硝化-好氧反硝化脱氮路径提供了基因水平上的证据。菌株基因组框架序列中并未检测到硝化相关的amo和hao基因，这在克雷伯氏菌属（Klebsiella sp.）KSND和克雷伯氏肺炎杆菌（Klebsiella pneumoniae）EGD-HPI9-C等HN-AD菌株中也发现了类似现象，可能是因为存在目前未知的酶与AMO/HAO酶功能相同，其可以氧化氨和羟胺，传统硝化的路径有待进一步完善。

综合分析菌株L12在含La(Ⅲ)条件下的氮源利用性能、产气及氮平衡以及脱氮关键酶活性和其相关编码基因，结果表明菌株L12主要通过同化为胞内氮和异养硝化-好氧反硝化产生氮气两条路径利用氨氮，其中以氨氮为唯一氮源的异养硝化-好氧反硝化的SND脱氮途径可能为NH₄⁺-N→NH₂OH→NO₂^--N→NO₃^--N→NO₂^--N→NO→N₂O→N₂（图6），这与许多异养硝化-好氧反硝化细菌脱氮路径相一致。此外，根据KEGG代谢通路注释，菌株L12的氨氮同化途径中还检测到编码谷氨酰胺合成酶的基因glnA和谷氨酸合成酶的基因gltB/gltD。谷氨酰胺合成酶可以将NH₄⁺-N转化为L-谷氨酰胺，谷氨酸合成酶可以将L-谷氨酰胺转化为L-谷氨酸。因此，推测菌株L12以氨氮为唯一氮源的同化路径可能为NH₄⁺-N→L-谷氨酰胺→L-谷氨酸（图6）。

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